一个负责将复杂组分尽量得分开，另一个通过分子量这个固有内标将化合物一个一个检测并定性定量；强大的分离能力加上强大的检测能力，就是LC-MS的无敌之处。
近年，化学合成的药物分子数量逐渐达到极限，而生物药由于其与疾病靶点天然的契合性，不但可以补充化学药物的缺口，还能实现更好的治疗效果，成为医药行业的新风口。这其中，蛋白质药物无疑是生物药研发中的热点，那么建立高通量、灵敏、准确的蛋白质药物定量分析方法就成了药物研发的关键前提。
与传统化学药相比，生物药成分更复杂，纯化更困难。在质量检测方面，由于采用生物发酵方法获得产物，对杂质、次级代谢产物、内毒素残留和核酸残留等，都要进行更严格的检验。这无疑对传统检测分析方法提出了更高的要求。高效液相色谱具有对成分复杂样品的高效分离能力，而质谱具有高选择性，要灵敏度，能够提供相对分子质量和分子结构信息。本文将重点分析LC-MS系统的流动相方法开发相关关键因素。
反向流动相
流动相的可选范围非常宽泛，这令流动相的选择难度远远大于固定相的选择难度，然而在实际的方法开发中，还是有方法可以极大的缩小选择范围，聚焦于成功几率更高的流动相条件。
典型反向溶剂
溶剂强度
典型的反向流动相是由弱溶剂和强有机溶剂共同组成的，那么乙腈或甲醇是最常用的两种有机溶剂。
洗脱强度
溶剂的疏水性，决定了它们洗脱能力的强弱，而溶剂的洗脱能力，又决定了被洗脱化合物所需的溶剂量，常用溶剂中，疏水性能的排列是乙腈大于甲醇大于水，所以乙腈是洗脱能力最强的溶剂。
甲醇
溶剂的洗脱选择性，是由溶剂的官能团决定的，甲醇溶剂既是氢键的强质子供体，又是强质子受体。甲醇的洗脱能力比乙腈弱，大概同时粘度大，当小颗粒长柱子的柱中高速流动时会产生较高的柱压。不过在苯基柱中，甲醇因能体现出苯基柱特有的pi-pi键选择性，而实现更好的分离性。
乙腈
乙腈是具有偶极矩的分子，氢键受体则非常弱。乙腈具有很多优良特性，是很多高效液相色谱中的理想溶剂，乙腈在混合体系中粘度较低，相对柱压就较低，乙腈的紫外截止波长为190nm，在很多化合物测定波长处是没有紫外吸收的，同时还有强洗脱性，缺点是价格较贵。
THF四氢呋喃可以接受氢键的质子，但不是氢键的质子供体。
用乙腈，甲醇，THF分别对相同的四种类固醇类物质进行分析，色谱图显示了三种溶剂间的选择性差异。
RP-HPLC的缓冲溶液选择
虽然可用的缓冲液种类的有很多，但常用的缓冲液并不多，同时要根据样品的实际条件，对各种缓冲液进行选择。
稳定性
在确定流动相pH时，要充分考虑目标物在环境中的稳定性，
水解
缓冲体系的pH过低，是否会引起色谱填料的水解？比TFA更强的酸会导致色谱填料的水解，硅羟基的暴露也会导致保留效果变差，同时不同厂家，不同品牌的填料，对于溶剂pH的要求也不相同，这些都是在工艺开发、转移、放大时需要考虑的。
溶解
pH过高时，硅胶会发生溶解，一般硅基相在pH8左右保持稳定，如果缓冲液pH在10左右，则需要对化学键进行保护处理，当pH升高到12左右，则需要含有有机硅杂化键的硅胶。
所以当我们为反向LC-MS选择流动相时，尽量避免使用强酸和强碱，如TFA会抑制信号。使用挥发性缓冲液代替磷酸盐。尽可能使用最好质量的水，如购买LC-MS级水，不使用超过一周的水相流动相。
值得注意的是，在HPLC中使用的许多缓冲液在LC-MS中都不能使用，如TFA和磷酸盐缓冲液，对质谱分析有影响，所以需要用甲酸，乙酸胺来代替使用在LC-MS中。
pH的影响
pKa以下2个单位
酸性样品pH流动相以下2个单位左右，在反向条件下保留效果更好，离子化状态可以得到更好的峰型，同时减少次价离子键相互作用的机会，但对于保留时间相对靠后的峰宽可能有影响。碱性样品与之相反。
pKa
相同的pKa是一个需要避免的pH区间，由于此时物质以不同浓度同时存在于水相和疏水相中，这会造成物质的色谱峰变宽和不对称，而且次价键的相互作用的可能性很大。这和碱性样品性质相同。
pKa以上2个单位
酸性样品同样应该避免的区间，与低pH相同，此时样品同时存在于水相和疏水相中，同样会造成物质的色谱峰变宽和不对称，而且次价键的相互作用的可能性很大。碱性样品则与之相反。
梯度洗脱法
梯度洗脱是用来分离同一色谱中疏水性差异较大的物质，这些物质在相同时间长度的等度洗脱时是无法分离的。梯度洗脱可以让峰型更窄，适合定量，并改善强度小，洗脱完的色谱峰的检测。同时梯度洗脱对于色谱柱的清洗，和再生非常方便，也有利于对于被分析物的条件摸索。
梯度斜率
梯度洗脱是的斜率变化，类似于等度洗脱时溶剂的强度。增大梯度洗脱的斜率或等度洗脱的溶剂强度，都可以减少分析时间，但也会降低分辨率。反之亦然。同时这两者也会影响选择性。梯度洗脱的目的就是在分析时间最小化的时候获得最优化的分辨率。
梯度洗脱与等效洗脱的比较
上图为等度洗脱，下图为梯度洗脱
我们可以看出，梯度洗脱的分辨率更好，特别是峰1和峰2的分离，同时梯度洗脱也节约了更多分析时间。
RP-HPLC的缓冲溶液选择
初试梯度
初试梯度用来测试分析物的洗脱时间，如在60min内，有机相从20%变化到80%。
调整起始有机相浓度
调整有机相递增浓度，能够调整早洗脱物质的出峰时间，减少分析时间。如以2、3、4%/min的递增速度洗脱。
优化分辨率
同时，调整起始有机相的浓度，可以在出峰时间和分辨率两者中取最优方案。如以20%、30%浓度的有机相作为起始浓度。通常会对有机相浓度进行不断优化，以获得最高得分辨率和最少的分析时间。
柱清洁
影响色谱柱清洁的环节是梯度末有机相浓度%的优化。如在柱清洁时显等度保持10min，然后将有机相浓度%梯度增加至90%保持2min，然后回到起始条件保持3min以平衡色谱柱，再进下一针样品。
温度的选择
温度的影响
由于温度对HPLC的选择性的影响没有稳定规律，所以在方法开发时就一定要对温度特别注意。温度较高时能降低流动相粘度和柱压，适合于流速更高、柱长更长、颗粒更小的柱子。与室温相比，将高的温度也能减少洗脱时间和提高方法的重现性。不过这样的影响需视样品实际情况而定，复杂样品的分离，温度的选择只有相对优化，并没有绝对改善。
方法开发中的温度
一般的方法开发，是以30摄氏度为初始温度进行色谱柱的筛选，流动相的选择与优化。只有在需要减少柱压、或分辨率不能满足需求时，才会提高使用温度。
总结
本文为大家梳理了与方法开发相关的流动相组成，包括如何根据溶剂强度和洗脱强度来选择溶剂，还在缓冲溶液的选择部分阐述了pH的重要性，对比了等度洗脱和梯度洗脱的特点，以及梯度洗脱的方法建立。以及温度对与方法的影响。
